:: EXTRACCION DE ADN DE HUESO ::
     
 
 
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Extracción de ADN de Hueso
   
         
 
 

ESTE PROTOCOLO FUE DESARROLLADO EN COLABORACIÓN DE PROMEGA PARA PROCESAMIENTO DE MUESTRAS DE HUESO PULVERIZADO EN PREPARADOS CON ADN PURIFICADO USANDO EL SISTEMA DNA IQ (CAT. # DC 6700 y DC 6701 ). EL ADN PURIFICADO RESULTANTE PUEDE SER USADO COMO PATRÓN EN REACCIONES PARA SECUENCIAS GENÓMICAS Y MITOCONDRIALES. ESTE PROTOCOLO HA SIDO PROBADO EXTERNAMENTE BAJO CONDICIONES VARIADAS EN RESTOS HUMANOS EN CEMENTERIOS, PERO DEBIDO A SU NATURALIEZA LA CALIDAD PUEDE SER LIMITADA POR FACTORES COMO EL TIEMPO, LA TEMPERATURA, EL MEDIO AMBIENTE, CONDIONES DE HUMEDAD, INFLUENCIA DE QUIMICOS, ETC. EL ADN ES CAPÁZ DE SER AMPLIFICADO, PERO PODRÍA NO SER OBTENIDO DE TODAS LAS MUESTRAS. POR AÑADIDURA, AL DNA IQ SYSTEM, A LA PROTEINASA “K”, Y AL “DTT”, LA MARCA PROMEGA OFRECE EL PULIDOR “LYSIS” DNA IQ ASÍ COMO LA PRODUCCIÓN ESTANDAR DEL PULIDOR DE INCUBACIÓN DE HUESOS USADO EN ESTE PROTOCOLO.
EL HUESO DEBERÁ SER PRE-PROCESADO EFICIENTEMENTE PARA LA EXTRACCIÓN DEL ADN DE LA MATRIZ DE CALCIO. EL ÉXITO DE LA EXTRACCIÓN DEPENDE DEL GRADO DE TRITURADO QUE PUEDE SER FÍSICO Ó CON UN TALADRO A BAJA VELOCIDAD PARA REDUCIR EL CALOR DESARROLLADO. EL PROCESO TRABAJA MÁS EFICIENTEMENTE CUANDO LOS FRAGMENTOS SE PROCESAN EN PARTÍCULAS MÁS FINAS EN LAS CUALES LAS CÉLULAS INTERCALADAS EN LA MATRIZ DEL HUESO SON MÁS ACCESIBLES PARA LYSIS.
EL ÉXITO EN LA PURIFICACIÓN NUCLEAR Ó MITOCONDRIAL DEL ADN DE HUESO DEPENDE TAMBIÉN DE LA INTEGRIDAD DEL ADN. LAS CONDICIONES DE LA TIERRA Y LA HUMEDAD TIENEN EFECTO EN LA CALIDAD DEL ADN. LA RESINA DNA IQ REMUEVE FRAGMENTOS MUY PEQUEÑOS QUE PUEDEN ACTUAR COMO INHIBIDORES PCR AUMENTANDO LOS RESULTADOS DE LA AMPLIFICACIÓN.
SIN EMBARGO, SI EL ADN DEGRADADO EN FRAGMENTOS ES MUY PEQUEÑO, NO SE OBTENDRA EL ADN. CON EL SISTEMA DNA IQ EL ADN MICROBIAL CONTAMINADO SE AISLARÁ ADICIONANDOSE AL ADN HUMANO DESCARTANDO Ó ELIMINANDO LA CAPA SUPERFICIAL EXTERIOR DEL HUESO, ESTO ES ACONSEJABLE ESPECIALMENTE CUANDO SE EXAMINA EL ADN MITOCONDRIAL.

     
             
REACTIVOS DISPONIBLES DE PROMEGA

• PROTEINASA K CAT. # V 3021.
• PULIDOR DE INCUBACIÓN, “HECHO A LA MEDIDA” SOBRE PEDIDO DE PROTEINASA K LYOFILIZADA PARA RECONSTITUCIÓN.
• PULIDOR DE INCUBACIÓN EN HUESOS.
• DNA IQ SYSTEM CAT. # DC 6701 PARA PURIFICACIÓN DE AND EXTRAIDO.
• PULIDOR LYSIS DNA IQ.
• DTT CAT. # 3151.
• POLYATRACT 1000 SOPORTE DE SEPARACIÓN MAGNETICA CAT. # Z 5410 Ó TECNOLOGÍA DE SOPORTE DE SEPARACIÓN MAGNETICA MAGNESPHERE CAT. # Z 5332 Ó Z 5342.

* REACTIVOS DISPONIBLES SOBRE PEDIDO, CONTACTE A PROMEGA PARA INFORMACIÓN ADICIONAL.
CONDICIONES PARA ALMACENAJE:
ALMACENE LA PROTEINASA “K” , EL DTT, EL PULIDOR DE INCUBACIÓN DE HUESO Y EL PULIDOR DE INCUBACIÓN A UNA TEMPERATURA DE –20° C. EL PULIDOR DE INCUBACIÓN PUEDE LLEGAR A FORMAR UN PRECIPITADO SI SE ALMACENA A UNA TEMPERATURA MENOR QUE LA DE LA HABITACIÓN. CALIENTE EL PULIDOR DE INCUBACIÓN PARA DISOLVER EL PRECIPITADO. TODOS LOS DEMAS COMPONENTES PUEDEN SER ALMACENADOS A TEMPERATURA AMBIENTE (25° C + -).

PROTOCOLO PARA EXTRACCIÓN DE ADN DE HUESO
MATERIAL APORTADO POR EL USUARIO:
• BAÑO MARIA A TEMPERATURA DE 56° C.
• BLOQUE DE CALOR A 65° C.
• ETANOL CONCENTRACIÓN DE 95 a 100 %.
• ALCOHOL ISOPROPÍLICO.
• TUBOS DE 15 ml.
• TUBOS PARA CENTRIFUGADO 1.5 ml.
• MICROPIPETAS CON PUNTAS RESISTENTES A AEROSOL.
• PROTEINASA “K” (MCA. PROMEGA CAT. # V 3021).
• PULIDOR PARA INCUBACIÓN (PARA PROTEINASA K LYOFILIZADA RECONSTITUIDA).
• PULIDOR PARA INCUBACIÓN DE HUESO.
• DNA IQ SYSTEM (CAT. # DC 6700 y DC 6701).
• PULIDOR LYSIS DNA IQ.
• DTT (MCA. PROMEGA CAT. # V 3151).
• SISTEMA POLYATRACT 1000 SOPORTE DE SEPARACIÓN MAGNETICA CAT. # Z 5410 Ó TECNOLOGÍA DE SOPORTE DE SEPARACIÓN MAGNETICA MAGNESPHERE CAT. # Z 5332 Ó Z 5342
A. PREPARACIÓN DE REACTIVOS
 
PREPARACIÓN DE SOLUCIÓN DE PROTEINASA K “DIGERIDA”.
PREPARACIÓN DE EXISTENCIAS DE SOLUCIÓN DE PROTEINASA “K”.
1. AGREGUE 5.5 ml DE PULIDOR DE INCUBACIÓN POR 100 mg DE PROTEINASA “K” Y REVUELVA SUAVEMENTE PARA DISOLVER. LA CONCENTRACIÓN FINAL DE PROTEINASA “K” DEBERÁ SER DE 18 mg/ml.
2. DISTRIBUYA LAS SOLUCIONES PREPARADAS DE LA SOLUCIÓN DE PROTEINASA K EN PEQUEÑAS ALÍCUOTAS QUE REFLEJEN UTILIZACIÓN Y ALMACENAJE A –20° C HASTA POR UN AÑO. PARA CADA MUESTRA SE REQUIEREN 168 uL DE SOLUCIÓN PREPARADA. LA PROTEINASA K PUEDE SER CONGELADA Y DESCONGELADA HASTA POR CINCO OCASIONES SIN DISMINUIR SU CALIDAD SIGNIFICATIVAMENTE. ANTES DE USAR DEBERÁ SER DERRETIDA Y ALMACENARSE EN HIELO.
   

1. LA SOLUCIÓN DEBERÁ PREPARARSE Y USARSE DE INMEDIATO. PARA CADA MUESTRA SE REQUIERE HASTA 3 ml DE SOLUCIÓN DIGERIDA. PREPARE LA SOLUCIÓN DE PROTEINASA K DIGERIDA COMBINANDOLA CON EL PULIDOR INCUBACIÓN DE HUESO Y ALMACENE LA SOLUCIÓN DE PROTEINASA K EN LAS PROPORCIONES QUE SE INDICAN A CONTINUACIÓN:

 

PULIDOR DE INCUBACIÓN DE HUESO:
944µl
Stock Proteinase K Solution
56µl
VOLUMEN TOTAL
1000µl

 

2. MEZCLE SUAVEMENTE Y ALMACENE A TEMPERATURA AMBIENTE ANTES DE USAR.

 
       
             
                 
PREPARACIÓN DE DTT 1M.
PREPARACIÓN DE PULIDOR LYSIS.
1. DISUELVA 5 gr DE DTT EN POLVO EN AGUA LIBRE DE NUCLEASA PARA UN VOLUMEN FINAL DE 32.4 ml.ml.
2. AGREGUE A LA SOLUCIÓN DE ALÍCUOTA QUE REFLEJE EL USO Y CONGELE A –20° C.
1. DETERMINE LA CANTIDAD TOTAL DE PULIDOR LYSIS PARA SER UTILIZADA (VER PASO 4 SECCIÓN B A CONTINUACIÓN).
2. AGREGUE 1 ul DE DTT 1M POR 100 ul DE PULIDOR LYSIS.
     
PREPARACIÓN DE DNA IQ 1X PULIDOR DE LAVADO
B. EXTRACCIÓN DE ADN DE HUESO

1. PARA EL DNA IQ SYSTEM (CAT. # DC 6700 PARA 400 REAC.) AGREGUE 35 ml DE ETANOL 95-100 % Y 35 ml DE ALCOHOL ISOPROPILICO AL PULIDOR DE LAVADO 2X. PARA EL DNA IQ SYSTEM (CAT. # DC 6701 PARA 100 REAC.) AGREGUE 15 ml DE ETANOL 95-100 % Y 15 ml DE ALCOHOL ISOPROPILICO AL PULIDOR DE LAVADO 2X.
2. REMPLACE LA TAPA Y MEZCLE VOLTEANDO EL FRASCO VARIAS VECES. MARQUE LA ETIQUETA PARA INDICAR LA ADICIÓN DE ALCOHOLES. LA SOLUCIÓN PUEDE SER ALMACENADA A TEMPERATURA AMBIENTE. ASEGURESE QUE EL FRASCO ESTA BIEN CERRADO PARA EVITAR EVAPORACIÓN.
1. PULVERIZE HASTA 2 gr DE HUESO OBSERVANDO LAS PRECAUCIONES ADECUADAS PARA EVITAR CONTAMINACIÓN Y EXCESO DE TEMPERATURA. LA CANTIDAD DE HUESO USADA INICIALMENTE DEPENDERÁ DE LA CALIDAD DE LA MUESTRA DE HUESO. EVITE LA OTRA SUPERFICIE DEL HUESO ESPECIALMENTE SI EL ADN MITOCONDRIAL YA HA SIDO EXAMINADO, A FIN DE REDUCIR CONTAMINACION.
2. COLOQUE EL HUESO EN 8 ml DE SOLUCIÓN DE PROTEINASA K DIGERIDA FRESCA EN UN TUBO DE 15ml É INCUBE A 56° C DURANTE UNA HORA.
NOTAS:
1. HUESO MOLIDO TOSCAMENTE REQUIERE MAYOR TIEMPO DE INCUBACIÓN.
2. AGREGUE SOLUCIÓN DE PROTEINASA K DIGERIDA HASTA CUBRIR POR COMPLETO LA MUESTRA.
3. REMUEVA EL SOBRANTE DE HUESO POR CENTRIFUGADO A 500 R. P. M. DURANTE CINCO MINUTOS. TRANSFIERA LA SOLUCIÓN A UN TUBO (NUEVO) DE 15 ml.
4. AGREGUE DOS VOLUMENES DE PULIDOR LYSIS DNA IQ A LA SOLUCIÓN.
5. COLOQUE EN EL VORTEX LA BOTELLA DE RESINA DE DNA IQ DURANTE 10 SEGUNDOS HASTA QUE LA RESINA QUEDE EN SUSPENSIÓN. AGREGUE 15 ml DE RESINA A LA MUESTRA. GUARDE LA RESINA RE-SUSPENDIDA EN LA BOTELLA ALMACENADA MIENTRAS REPARTE PARA OBTENER RESULTADOS UNIFORMES.
6. COLOQUE EN EL VORTEX LA MUESTRA / PULIDOR LYSIS / RESINA MEZCLADA DURANTE 5 SEGUNDOS A ALTA VELOCIDAD.
7. INCUBE A TEMPERATURA AMBIENTE DURANTE DIEZ MINUTOS MEZCLANDO POR INVERSIÓN DEL TUBO.
     
 

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